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CD33（CD33）

次瀏覽 | 更新時(shí)間：2023-05-22

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CD33

CD33是髓系細(xì)胞分化抗原，分子量為67KD，主要分布在髓系血細(xì)胞，特別是在分化的早期階段。

基本信息

中文名	髓系細(xì)胞分化抗原
別名	CD33
分子量	67KD
主要分布	在髓系血細(xì)胞，特別是在分化的早期階段
分布	髓系血細(xì)胞

定義

其胞內(nèi)區(qū)含有免疫酪氨酸抑制基序（ITIM），所以它可能具有通過募集信號(hào)分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化等功能。

特點(diǎn)

CD33在90%以上的急性髓系白血病患者都有表達(dá)。在造血干細(xì)胞表面沒有表達(dá)，在成熟的粒細(xì)胞和其他組織也沒有表達(dá)，因此CD33成為髓系白血病治療的良好靶點(diǎn)。

增強(qiáng)抗腫瘤免疫

基本原理

有文獻(xiàn)證實(shí)AML細(xì)胞表面免疫共刺激分子CD80表達(dá)低下或缺乏，是導(dǎo)致白血病細(xì)胞不能被機(jī)體細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）有效地識(shí)別殺傷，從而逃逸宿主免疫監(jiān)視的重要原因之一，而T細(xì)胞也因缺乏第二信號(hào)而無能。因此可以利用CD33表面抗原作為AML白血病細(xì)胞的表面標(biāo)記，構(gòu)建CD80胞外區(qū)-抗人CD33單鏈抗體（ExCD80-CD33scFv）融合基因、表達(dá)融合蛋白，通過融合蛋白中抗人CD33scFv將CD80胞外區(qū)結(jié)合到AML白血病細(xì)胞表面，刺激腫瘤特異性CTL細(xì)胞活化，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

研究目的

構(gòu)建及表達(dá)抗人CD33單鏈抗體（CD33scFv）基因，并檢測其生物活性；擴(kuò)增CD80胞外區(qū)，構(gòu)建ExCD80-CD33scFv融合基因，并在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，進(jìn)一步檢測融合蛋白的生物活性。

方法

HIM3-4是血研所研制的分泌鼠源性抗人CD33單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并已獲得國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組會(huì)議正式命名。我們利用RT-PCR技術(shù)分別克隆了抗人CD33單克隆抗體HIM3-4的輕、重鏈可變區(qū)基因，并利用短肽（Gly4Ser）3作為linker,通過overlap PCR方法組裝成抗人CD33scFv。將獲得的抗體基因克隆到具有強(qiáng)啟動(dòng)子的PET28a（+）載體上，應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)證明具有與靶抗原人類CD33特異結(jié)合的能力。CD80 DNA序列由王敏教授惠贈(zèng)，我們通過另行設(shè)計(jì)帶所需酶切位點(diǎn)的引物來擴(kuò)增CD80胞外區(qū)，在此基礎(chǔ)上，利用人血清白蛋白（HAS）第三結(jié)構(gòu)域親水性的403-427位氨基酸作為鏈間連接肽將抗人CD33單鏈抗體及人類細(xì)胞表面抗原CD80胞外區(qū)基因分別經(jīng)酶切、純化后克隆至原核表達(dá)載體PET22b（+）中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌內(nèi)獲得了融合蛋白的表達(dá)。融合蛋白的成功構(gòu)建與表達(dá)，為下一步探討血液腫瘤的免疫治療機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果:1.通過RT-PCR方法，利用通用引物從HIM3-4雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，分別為321bp和366bp，我們利用（GGGG）3為連接肽構(gòu)建了抗人CD33基因工程單鏈抗體，并在PET28a（+）中得到表達(dá)，蛋白大小約為31KD,經(jīng)復(fù)性后具有與人CD33結(jié)合活性。2克隆出CD80胞外區(qū)序列，大小為633bp。3利用大小為25Aa的鏈間鏈接肽，將CD80胞外區(qū)與CD33ScFv連為融合表達(dá)基因，并在PET22b（+）中得到表達(dá)，蛋白大小約為55KD,經(jīng)復(fù)性后具有與人CD33抗原結(jié)合活性。

結(jié)論

從HIM3-4雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，經(jīng)測序?yàn)楣δ苄灾嘏诺目贵w可變區(qū)基因。

用（Gly4Ser）3連接肽基因?qū)H、VL連接成scFv基因，并用表達(dá)載體PET28a（+）表達(dá)了scFv蛋白。

擴(kuò)增了人類ExCD80 cDNA序列，測序顯示序列正確。

構(gòu)建了PET22b（+）-ExCD80-CD33scFv融合基因表達(dá)質(zhì)粒，并在含有稀有密碼子的宿主菌Rosetta（DE3）中獲得了表達(dá)。并初步探討了其生物學(xué)功能。

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