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蔗糖酶（催化蔗糖水解為果糖葡萄糖的酶）

次瀏覽 | 更新時間：2023-05-22

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蔗糖酶

催化蔗糖水解為果糖葡萄糖的酶

蔗糖酶又稱“轉(zhuǎn)化酶”。糖苷酶之一，蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的β-D-呋喃果糖苷鍵水解，具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。

基本信息

中文名	蔗糖酶
別稱	轉(zhuǎn)化酶
最適溫度	40℃~50℃
最適PH	4.0~4.5

基本介紹

蔗糖酶。糖苷酶之一。催化蔗糖水解成為果糖和葡萄糖的一種酶，廣泛存在于動植物和微生物中，主要從酵母中得到。

自1860 年Bertholet 從啤酒酵母 Sacchacomyces Cerevisiae 中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來, 它已被廣泛地進(jìn)行了研究。蔗糖酶（β -D-呋喃果糖苷果糖水解酶，fructofuranoside fructohydrolase， invertase）（EC 3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的α-呋喃果糖苷鍵水解, 具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。

該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè),在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為外蔗糖酶(external yeast invertase)，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% ~70(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 糖成分的糖蛋白；在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基（二聚體）結(jié)構(gòu)，2種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個亞基比內(nèi)酶多2種氨基酸——絲氨酸和蛋氨酸，它們的分子質(zhì)量也不同，外酶約為270KD（或220KD,與酵母的來源有關(guān)），內(nèi)酶約為135KD。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，但由于內(nèi)酶含量很少，極難提取。

作用

蔗糖在蔗糖酶的催化下．水解為D-葡萄糖和D-果糖兩種還原糖。蔗糖酶在植物的運(yùn)輸貯藏、碳水化合物代謝中發(fā)揮主要作用．并在滲透調(diào)節(jié)、抗逆性生長繁殖、以及信號傳導(dǎo)方面也發(fā)揮著重要的作用。

植物中蔗糖酶的分類

根據(jù)植物中蔗糖酶所處亞細(xì)胞位置，蔗糖酶可分為液胞型蔗糖酶、細(xì)胞質(zhì)型蔗糖酶和細(xì)胞壁型蔗糖酶。前兩者又統(tǒng)稱為胞內(nèi)蔗糖酶，細(xì)胞壁型蔗糖酶又被稱為胞外蔗糖酶。不同的蔗糖酶進(jìn)行反應(yīng)所需的最適pH值也有所不同，由此蔗糖酶又可分為酸性蔗糖酶和中性/堿性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和細(xì)胞壁型蔗糖酶在pH4.5至5.0時催化效率最高，因此也稱為酸性蔗糖酶。細(xì)胞質(zhì)型蔗糖酶水解蔗糖的最適pH值為中性或略微偏堿性，因此稱為中性/堿性蔗糖酶。而根據(jù)其溶解性，蔗糖酶又可分為可溶性蔗糖酶（包括液胞型蔗糖酶和細(xì)胞質(zhì)型蔗糖酶）與非溶性蔗糖酶（細(xì)胞壁型蔗糖酶）。

提取方法

酵母提純

酵母離心(8 000 r/min)15 min后收集菌體。將收集到的菌體用蒸餾水洗滌，離心，再洗滌，重復(fù)數(shù)次，直到菌體呈白色，傾出上清液，將不含雜質(zhì)的干凈的酵母保存待用。

粗酶液的制備

準(zhǔn)確稱取離心分離后的酵母10g，加入60mL0．5mmol/L的SDS溶液溶解，在pH值為5．5、50℃水浴中加熱12h后取出，4℃、10 000 r/min離心20 min．上清液即為粗制酶液。4℃保存。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)。以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)。以吸光度為縱坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．

蔗糖酶活性的測定

稀釋酶液0．5 mL．加入0．3 mL pH值為4．6、0．1 mol/L的NaAc—HAc緩沖液．0．2 mL 0．1 mol/L的蔗糖溶液．37℃準(zhǔn)確反應(yīng)15rain后．加0．125 mL l mol/L的NaOH溶液中止反應(yīng)。用DNS法在540 nm波長下測定形成的還原糖量。在該條件下。蔗糖酶液1 min轉(zhuǎn)化底物蔗糖生成1g葡萄糖定義為1個活力單位。

粗酶的乙醇初步分離

在所提粗制酶液中加入乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)30%，4℃放置過夜，4℃、10 000 r/min離心15 min．取上清液．追加乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)50%，4℃放置1 h，4℃、11 000 r/min離心15 min．棄上清液．沉淀用雙蒸水溶解．4℃保存。經(jīng)SDS抽提法提取．質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙醇沉淀所得的酶液用透析法(pH值為7.0的0.05 mol/L%s—HCI緩沖液)充分透析。所得透析液4℃保存。

SDS抽提法提取啤酒酵母中蔗糖酶

工藝條件優(yōu)化：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上。選取SDS摩爾濃度、pH值、提取溫度、提取時間4個條件，考察其對酵母蔗糖酶抽提效果的影響．采用4因素3水平正交表L93。做正交試驗(yàn)。

蔗糖酶的純化

采用O一瓊脂糖凝膠 FF陰離子交換柱層析純化粗酶液。將SDS抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗制酶液經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙醇沉淀，溶解透析后，過Q-瓊脂糖凝膠FF陰離子交換柱(用pH值為7．0、0．05 mol/L Tris-HCl緩沖液充分平衡)。用0～1 mol/L、60 min線性梯度的NaCI溶液(內(nèi)含pH值為7．0、0．05 mol/L%s-HCI緩沖液)洗脫。體積流量為0．5 mL/min，每管收集mL。測定各管洗脫液的蔗糖酶活性與蛋白質(zhì)含量，合并蔗糖酶活力高的若干管流出液。流出液經(jīng)過透析脫鹽,真空干燥后即為純化的酵母蔗糖酶。

參考資料

[1]

萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺 · 萬方數(shù)據(jù)[引用日期2021-11-07]

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