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顯微攝影（應用于動植物檢疫工作的技術）

次瀏覽 | 更新時間：2023-05-19

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顯微攝影

應用于動植物檢疫工作的技術

顯微攝影是通過顯微鏡來拍攝的方法。在動植物檢疫工作上是科學研究、經驗交流、仲裁談判不可缺少的手段之一。要取得良好的顯微攝影效果，最重要的是要有良好的顯微鏡設備和良好的顯微鏡操作技術。

基本信息

外文名	Photographic photography
拍攝工具	顯微鏡
方法	通過顯微鏡來拍攝

基本簡介

意大利帕多瓦大學地質學者伯納多·凱撒晃動濾光器、瞄準鏡以及不斷變換方向，才拍攝到這張輝長巖的微觀圖片。這些巖石沒有特別的科學意義，但里面有很多微小的橄欖石，看起來非常美麗。

顯微攝影是把顯微鏡的物鏡和目鏡所組成的光學成像系統(tǒng)作為照相機的鏡頭去拍攝一般用肉眼無法看清的標本。這種對微小物體“放大錄像”，可直接為教學，科研提供方便。根據(jù)顯微鏡的結構可知：當被觀察的標本放在物鏡前焦點稍外一點的位置時，將在目鏡前焦點內側且靠近焦點的位置處形成一個放大倒立的實像，這時再通過目鏡（這時的作用象普通放大鏡）就可看到一個放大倒立的虛像。

如果調節(jié)物鏡成像的位置（可使標本適當遠離物鏡或升高目鏡，即增大目鏡與物鏡間的距離，使中間成像介于目鏡的一倍焦距與兩倍焦距之間），使物鏡所成的像位于目鏡前焦點的外側，此像再經過目鏡放大，即可在目鏡的另一側得到一個經二次放大的正立實像，當光源足夠強時，此像可使底片或相紙感光，或者使數(shù)碼相機、攝像機的CCD光電元件感光成像，這就是顯微攝影的原理。

操作方法

顯微攝影

要獲得一張好的顯微攝影照片，必須注意滿足以下幾個條件：1制作清晰的標本片，其中組織切片應厚薄適度，染色片不應有多余的染料等。2選擇性能優(yōu)良干凈的載玻片和蓋玻片。3使用高性能的物鏡(最好用復消色差的平場物鏡)和聚光器。4采用Kohler照明法。5選擇好合適的拍攝膠片。⑥拍攝時應準確地聚焦和選擇合理的曝光時間。⑦正確的沖印方法。

下面以日本Olympus PM-10AD全自動顯微攝影裝置為例來介紹具體的操作步驟。

(1) 裝配

Olympus PM-10AD顯微攝影系統(tǒng)的裝配圖。

加選擇135相機拍攝時，首先應將適配器PM-PBS的上部裝上135照相機，前端裝上聚焦用望遠鏡PM-VTM。然后在顯微鏡的直筒部分加上適當倍數(shù)的NFK攝影目鏡(如3.3x)，并將上述PM-PBS安裝在該目鏡上。最后應將PM-PBS與自動曝光控制器PM—CBAD之間的連接線裝好并分別將顯微鏡和PM-CBAD的電源接通，并注意檢查電壓選擇范圍是否與所用電源相匹配。

(2)用前檢查

在開啟顯微鏡和曝光控制器電源后，在安裝膠卷前，應按以下方法先檢查該裝置的工作是否正常。其方法是：先將曝光裝置PM-PBS上的光路控制拉桿向外拉出—個位置(綠色環(huán))并把曝光控制器PM—CBAD上的曝光方式調至“AUT0”位，ASA速度至所用膠卷的感光速度ASA數(shù)值，這時再按下法檢查：

1)曝光控制器上的“SAFETY”綠色指示燈應亮。

2)輕按快門按鈕時，“WORK”燈應亮。

3)當快門關閉時，“WORK”燈應熄滅，并同時可見“WINDING”燈亮和聽見卷片的馬達聲。

(3)膠卷的安裝

操作時一般不取下相機，直接在本裝置上裝片或退片。正確的裝片方法如下：

1）將倒片鈕向外拉出，后蓋即打開。將135膠片放入倒片鈕下方的片槽內然后讓倒片鈕復位。

2)將片頭插入卷片軸縫隙中，注意不要讓片尖從袖縫的另一端伸出。按控制器上的進片按鈕(TIME OFF／WINDING)拖片直至使膠片兩端的片孔全部嵌入卷片齒輪中為止。

3)將后蓋重新蓋好，再按進片鈕拖片2-3次，直至計數(shù)器上顯示出“1”為止。

4)為避免忘記所用的膠片類型，最好將包裝盒的一角撕下，插入后蓋外部的插片腔中。

(4)退片

當膠卷全部拍攝完畢之后，控制器上的“FILM END”燈將點亮并出現(xiàn)報警

鈴聲。在取下相機或直接倒片后按“TIME OFF”鈕可使報警聲停止。

1)將相機上的退片鈕反時針旋轉90。

2)向外拉出退片手柄，順時針方向將膠片倒入暗盒，至拉力突然降低

轉無阻力時則表明膠片已全部倒入暗盒。此時即可開蓋取出已拍完的膠卷。

3)退片手柄在膠片完全退回后將自行復位。

(5)黑白顯微攝影

先將拍攝標本準確聚焦，并用調焦望遠鏡選好待拍標本區(qū)。拍攝步驟如下：

1)將“MODE／EXPOSURE TIME”調至“AUTO”；按下“FORMAT”選擇鍵中的“35”；把“ASA”調至所用膠片的感光速度ASA值；將“RE-CIPROCITY，調至膠片的相應數(shù)值(可參見控制器底部的塑料說明板，除特殊要求外，通常應放在“4”位上)。

2)檢查SAFETY指示燈是否為綠色，若為紅燈應作以下檢查：A．若紅燈

閃現(xiàn)并同時有報警聲，說明曝光過度，應用中性濾光片降低照明亮度，一般不宜

采用降低電壓以減小照明亮度的方法。B．若紅燈連續(xù)亮則表明曝光不足，應增

加亮度。

3)將“EXPOSURE ADJ”調至適當值。一般用明視野照明而樣品又均勻分布時，應調至(1)；若樣品分布不均勻或用其他方式照明時則應進行適當?shù)恼{整：

4)拉下控制器上的曝光鈕，“WORK”燈將隨著曝光而開啟，曝光結束“WORK”燈燈滅，膠片將自動驅進一個片位。

(6)135彩色膠卷顯微攝影

進行彩色攝影的基本方法除色溫調節(jié)外，其余均與黑白顯微攝影相同。下面僅介紹調溫法；

1)將色溫檢測器PM-CTR安裝么自動曝光器PM-PBS的左側。

2)將標本片聚焦后讓視野移至無樣品的地方。

3)將光路控制拉桿移至最外部(黃色帶)；把色溫調節(jié)旋至“D”（日光型膠卷)或“T”(燈光型膠卷)。

4)在顯微鏡上加LBT(燈光型膠卷)或LBD-2(日光型膠卷)濾光片，調節(jié)顯微鏡的亮度使色溫調節(jié)器上的指示燈亮至A處(黃色)；若A處以上的綠燈亮表明色溫過高；A處以下的紅燈亮時表明色溫過低。

5)將光路控制桿向內推一步至綠環(huán)處，這時即可按上述黑白膠片的方法進

行顯微攝影。

(7)手動顯微攝影

在持殊情況下常常需要人為地改變曝光條件以求得更好的攝影效果經驗的操作者也可以選擇手動進行顯微攝影，其方法如下：

1)用“MODE／EXP0SURE TIME”鈕自行選擇曝光時間(可從1s-40min)。

2)按快門鈕，這時的快門將按設定的時間曝光。

3)若需要曝光時間超過40m可將“MODE鈕旋至T再按下快門鈕，快門將一直開啟，直至按動“TIME OFF／WINDING”鈕。

(8)自動曝光鎖定裝置的應用

在對同一標本片的不同位置或不同成分進行攝影時，常常要采用相同的曝光

時間，這時可按下“AE LOCK”鍵。在此后的拍攝中將維持相同的曝光時間，“TIME RECALL”燈將閃亮，直至“AE LOCK”鍵被重新按動后才被解除。

(9)多次重復曝光：其操作如下：

A．先將“ASA”鈕旋至8倍于膠片ASA值處(如將100ASA膠卷旋至800處)。

B．將“FORMAT”選擇的“L”鍵按下，這時就能對同一底片進行多次曝光。

C.結束后按下“35”鍵和“WINDING鍵，膠片將自動前進一個片位。

曝光控制

顯微攝影

雖然現(xiàn)在的相機均有自動測光或自動曝光功能，但是如果一個視野中亮處面積超過二分之一，則易出現(xiàn)曝光不足的現(xiàn)象，所以如果標本主體小，又處在亮背景中，就要適當增加曝光時間。

在控制曝光時，要注意以下因素：

光源強度的影響：由于電壓的變化，光源亮度可能產生5-10倍的變化。光源的距離及對標本的照射面積。光源的波長及色溫。光源的波長長、色溫低，色光偏紅時，曝光時間要長些。光波短，色溫高，色光偏青時，曝光時間要短些。電壓的波動會引起曝光量的改變，所以攝制過程中要保持電壓的相對穩(wěn)定。聚光器的位置經過實驗固定后不宜改動。使用濾色鏡、乳白玻璃、偏振鏡等都要按其曝光指數(shù)增加曝光時間（手動曝光）。目鏡的放大倍率。以×5倍的目鏡作曝光基準1時，×10倍目鏡要4倍的曝光量，×15倍目鏡要增至9倍的曝光。物鏡的倍率和N·A值：如果把×10倍的目鏡作為1時，×40倍目鏡要2.5倍的曝光，×100倍的物鏡要4倍的曝光。從目鏡出射點到感光片的距離標本的染色也會對曝光產生影響標本與目鏡間的介質折射率大、曝光時間短，反之，曝光時間長。曝光時間與折射率成反比。聚光鏡的光闌孔徑變化能使曝光產生2～20倍的變化。

反差控制

顯微攝影

顯微攝影的反差強一些為好，影響反差的因素有以下五個方面：

標本本身對反差的影響標本切片厚會產生光的折反射，同時細部結構產生重疊。標本新鮮、色彩鮮艷反差強。標本載物片厚或蓋片厚、有色、有水紋都會降低反差。照明對反差的影響：照明應適中，否則會降低反差，太亮會沖擊標本細部結構，太暗會使光路中的臟物呈現(xiàn)在影屏上。光束直徑與視場直徑一致時反差強，光束直徑大于視場直徑就會降低反差。集光器與虹彩對反差的影響：集光器過低、虹彩與光欄小，都會降低反差，所以要依具體情況升降集光器或開放虹彩。虹彩光闌的直徑必須與物鏡口徑一致。濾色片對反差的影響：用補色濾色片反差強，用統(tǒng)一色濾色片反差弱。

光學顯微攝影的反差雖然是大些為好，但也要適當處理，不然反差過大就會損失細部結構，同時也會影響分辨率，同樣不能得到完美的效果。

附：光學顯微鏡的構造、成像和性能

現(xiàn)代光學顯微鏡，基于不同用途、種類繁多，如有生物顯微鏡、金相顯微鏡，解剖顯微鏡等，但基本結構仍為光學和機械兩個部分。

單式光學顯微鏡（通常用的放大鏡、解剖鏡等）光學結構簡單、放大倍數(shù)小、光行差明顯，不宜進行顯微攝影，在這里就不作介紹了。

復式顯微鏡光學系統(tǒng)比較完善、機械裝置比較復雜，適合于顯微工作的開展：

1.顯微鏡的成像

顯微鏡的成象光路：

它通過目鏡、物鏡等光學器件構成放大光路，而使所得虛像A“B”的距離恰好等于人眼的鳴視距離——250毫米，以獲得將標本放大10～200倍的可見影像。

2.光學顯微鏡的基本結構

光學顯微鏡的基本構造分為兩部分。一部分是光學系統(tǒng)，如接目鏡、接物鏡、聚光器、光源等，另一部分是機械系統(tǒng)，如鏡腳、鏡臂、鏡筒、載物臺、物鏡轉換器、大小螺旋、推進器等。

（1）接物鏡

接物鏡是光學顯微鏡的關鍵部件，整個顯微鏡系統(tǒng)的成像質量與分辨率都由接物鏡決定。它由一組精密的透鏡組成，其作用是將檢視標本做第一次放大。顯微接物鏡生產時做過各種像差校正，它有一個光闌——孔徑光闌，可以控制入射光束的直徑，其作用是減小或擴大視場而不改變像的明亮度。

接物鏡有不同倍率其中干燥系用在正常情況下觀察。水浸系或油浸系在觀察時要在接物鏡口與標本結合處點水或點油。

由于接物鏡的成像質量影響攝影效果和觀察效果，所以接物鏡也是顯微攝影的重要組成部分。

接物鏡有三個主要參數(shù)——數(shù)值孔徑N·A值、放大率和蓋片厚度。它們都標在鏡頭殼上。

①N·A值

數(shù)值孔徑N·A是標志物鏡工作性能的重要參數(shù)，它決定了物鏡的分辨率。N·A=n·sinθ 式中n為介質折射系數(shù)，Q為入射角。

表明了物鏡數(shù)值孔徑與介質折射系數(shù)、入射角的關系。理論上的最大入射角為180°，它的一半（90°）的正弦等于1，而空氣的折射系數(shù)為1.0，水的折射系數(shù)為1.33，松節(jié)油的折射系數(shù)為1.5，所以在同樣入射角情況下液浸物鏡數(shù)值孔徑比干燥物鏡的大，因此分辨能力也大得多。

N·A值越大，分辨率越大，N·A值越小，景深與焦深越長。

N·A值尚與鏡口角有關，鏡口角越大，進光量越大，所視像野中的影像越清楚，分辨率就越大。反之，分辨率就小以致看不清楚。由于低倍物鏡的鏡口角小于高倍物鏡的鏡口角，所以低倍物鏡的分辨率就不如高倍物鏡的分辨率大。（這是指干燥系而言，油浸系物鏡有介質的折射率，可提高分辨率。

分辨率還受照明強度及光源波長的影響，在一定范圍內，照明強度大，分辨力就大。

②放大率

放大率是指檢視的放大倍率（即虛像放大倍率），倍率越大，工作距離越近。對每個具體物鏡來講，它的放大倍率是不變的，工作距離也是不變的。如果采用10×目鏡、40×物鏡，觀察時放大了400倍，但對顯微攝影來講，由于要增加目鏡到感光片的這段距離就不是400倍了，有些顯微攝影的攝影倍率是顯微鏡放大倍率的1/2。

③對蓋片厚度的要求

顯微鏡對蓋片的厚度要求為抽筒的1/100,達0.16～0.17毫米，每差±0.01毫米抽筒則必須相應改動10毫米，否則其放大倍率就不是標示的倍率了。

油浸鏡是借點油的折射率來提高視野的亮度和分辨率。點油后使接物鏡與標本構成一個光具組。

常用于油浸鏡的點油及折射率為：

洋杉木油1.51

檀香木油1.51

甘油1.46

樹膠1.52

蘇合香1.58

折射率越大呈像亮度越強，分辨率也就越大。

（2）接目鏡

接目鏡主要有以下兩個作用一是將物鏡送來的初級放大影像再作第二次放大。

二是矯正接物鏡成像中的相差、色差和照度。接目鏡的放大率一般從×4～×25，其鏡筒長的放大倍率大，反之，放大倍率則小。

眼點是目鏡的一個主要參數(shù)，在顯微攝影中為尤重要。眼點即顯微鏡對清焦點后在目鏡上形成的出射點。一般眼點距離目鏡0.5厘米左右，放大倍率越大，這段距離越短，放大倍率越小，這段距離越長。目視時，瞳孔恰與此點相接，用帶鏡頭的照相機攝影時，鏡頭的前片透鏡表面要與此點相接，用不帶鏡頭的攝影裝置拍攝時，要從眼點計算所加近攝裝置（伸縮皮腔形式或近攝接圈）的伸長尺寸，以計算實際倍率。

（3）聚光器

顯微鏡的聚光器有明視野聚光器、暗視野聚光器和特殊用途聚光器（如偏振光、相位差等等）。

①明視野聚光器

明視野聚光器由集光器、虹彩、濾色鏡環(huán)和反射鏡四個部分組成。

其中集光鏡由兩個或兩個以上透鏡組成，象一個簡單的照相機鏡頭，它的數(shù)值孔徑（N·A) 值為1.20～1.40左右。它的主要作用是提高象野的亮度和提高接物鏡對標本的分辨率。

②虹彩

結構像照相機的光圈，它不但可以調節(jié)照明強度，同時還具有改變分辨率和反差的作用，即：虹彩開大，分辨力高，反差弱，虹彩縮小則相反。濾色鏡環(huán)用來放置濾色片或毛玻璃，可用來改變光色或亮度。

反光鏡分為平凹兩面，并要使光束正好對準反光鏡中央。

③暗視野聚光器的視野背景是暗的，被攝體是發(fā)光的或明亮的。

暗視野聚光器通常用于拍攝極微小的物體，如化學明膠、梅毒螺旋體或明視野看不見、看不清沒有染色的標本。它也常常用于熒光顯微攝影。使用暗視野聚光器拍攝時光源亮度要強些，不能使用濾色鏡。為防止外來光線干擾，暗視野顯微攝影最好在暗室中進行。

3.光學顯微鏡的主要性能

光學顯微鏡的主要性能從兩方面體現(xiàn)，即放大倍率和分辨率。

（1）放大倍率

理論上講，光學顯微鏡的放大倍率在鏡筒長度為16～17厘米時為物鏡×目鏡倍率，但是我們要將實物看清，不僅僅是要將其放大，更主要的是分辨出它的細部形態(tài)，所以放大倍率要與物鏡、分辨率同時考慮。如，同樣是放大200倍的顯微鏡目鏡與物鏡，可以有三種組合方式，4 0×5、20×10、10×20，但是三種組合形式的分辨率、焦點深度與成像面的亮度、拍攝時需要使用的快門速度有很大差別。

物鏡（1） 20×10 （2） 41×5 （3） 10×20

物鏡的數(shù)值孔經分辨能力焦點深度焦平面亮度比照相快門速度 0.40 0.70μ 1.25μ 1.0 1/30秒 0.65 0.43μ 0.77μ 0.8 1/200秒 0.25 1.1μ 2.0μ 0.4 1/40秒

在顯微攝影中，其放大倍率與出射點至感光片的距離有關，所以顯微攝影的放大倍率的計算公式為M=物鏡倍率×目鏡倍率×目鏡出射點至底片的距離/250毫米。這個公式說明，只有當目鏡出射點至感光片的距離為250毫米時，顯微攝影的放大倍率才等于物鏡倍率×目鏡倍率，若將目鏡出射點到感光片的距離加大，其放大倍率也隨著加大，但這只是形態(tài)增大而分辨率不變。將底片用來放大照片時也只是形態(tài)的放大，而不增加分辨率。

感光材料

藻類共存　　在這張硅藻和紅藻的照片中，有機體與健康生態(tài)系統(tǒng)之間的聯(lián)系被以微觀形式表現(xiàn)出來，各種生命形態(tài)需要互相依賴才能生存。

一般為溴化銀乳劑，將其涂在膠片上就成為膠卷(底片)，如果將其涂在紙上就成為感光紙，曝光時在光的作用下部分溴化銀粒子被還原成金屬銀而形成潛像，這就是拍照過程。再經過顯影液的作用，潛像就變成黑色金屬銀留在乳劑中，金屬銀還原的多少即黑度的深淺與曝光時間的長短和光的強弱及波長有關，再經過定影液作用，將未還原的溴化銀熔解在定影液中，底片該處就呈透明，這時底片呈現(xiàn)與實物相反的影像，叫做負片。用印相紙復印，就能得到平常所見的照片，(復印是將印相紙的藥膜面和底片的藥膜面緊貼后曝光，再經顯影、定影處理后即得照片)。

實用顯微攝影的方法主要有三種（注：不包括本實驗所用的相紙感光）：

第一種方法是利用傳統(tǒng)的菲林相機，讓被攝物體成像于黑白或彩色膠片上，制成負片，再把它沖印放大成照片（正片），以便觀察研究和永久保存。或者讓被拍攝物體成像于反轉片上，直接制成正片，用于幻燈投影。要求不高時也可直接成像于相紙上，成為一負片，并不影響相片的分辨率。本物理實驗室為本、專科學生提供這一顯微攝影廣方法。

第二種方法是利用數(shù)碼相機，通過專用接筒或外接專用鏡頭，把被攝物體成像于數(shù)碼相機的內存中。成為一個壓縮的JPEG文件，傳輸?shù)接嬎銠C中，再利用圖像顯示軟件把圖像顯示于監(jiān)視器上，或者直接通過打印機輸出相片來。也可把圖像存貯于媒介上，如軟盤、閃存盤、光盤等，再通過數(shù)碼沖印商店，沖印出數(shù)碼相片。由于目前市場上大多數(shù)數(shù)碼相機都是不可變換鏡頭的相機（除了個別昂貴的專用數(shù)碼相機，如Nikon的Ｄ1型相機外），所以顯微鏡不設連接數(shù)碼相機的卡口，而通過加設一鏡頭接筒的方法，再連接某些特殊鏡頭結構的數(shù)碼相機，如本實驗采用的Nikon Coolpix 4500型數(shù)碼相機。

第三種方法，則是在顯微鏡上加接專用連接鏡頭，接上CCD攝錄鏡頭，再把動態(tài)的圖像傳送到計算機，通過軟件在顯示器上表現(xiàn)出動態(tài)圖像來，可把Video圖像存儲成某種格式的文件，如avi、mpeg或mov等。也可把瞬間的影像保存到計算機中，成為儲存器上的一靜態(tài)圖像的文件，如bmp、tif或jpg等，與數(shù)碼相機所獲得的圖像相似。這種方法的優(yōu)點是能夠獲得動態(tài)圖像，在視覺效果上更生動、更勝一籌。不過其靜態(tài)圖像的分辯率一般只能用于電視機或顯示器上的顯示，并不適合于打印輸出和印刷等領域。

微觀世界

植物生殖器官　　這是一張被顯微鏡放大了20倍的雄株芥末類植物的生殖器官，摘走了2009年尼康微觀世界攝影大賽的桂冠。擬南芥是第一種完成全部基因組序列測定的高等植物，也是最常用于科學研究的植物，但這種植物此前卻從未展示過藝術美感。

續(xù)斷菊花莖這是一張續(xù)斷菊花莖部的橫截面圖片，續(xù)斷菊是鄉(xiāng)間最常見的一種黃色野花。攝影師格雷德·岡瑟說：“續(xù)斷菊毛狀物的紅帽與綠白相間花莖之間的強烈對比，令我感到戰(zhàn)栗。”這張圖片是在被放大150倍拍攝的，顯示出自然界的神奇。

光刻膠是工業(yè)生產中常用的感光材料。在200倍顯微鏡下，看起來非常美麗，就像太陽用其龐大熱能溫暖著地球。

卵巢螺旋這是一個發(fā)育中的卵子，在琵琶魚的卵巢中做螺旋式移動。攝影師在卵巢壁上加了顏色，看起來特別明顯。這幅圖既有其藝術美感，又具有科學價值，可以證明卵巢和卵子的結構。

可愛的海星這幅圖是一只饑餓的小海星正張開嘴，用透明的管狀肢體抓住微生物吃。這張圖片是在放大40倍情況下拍攝的，小海星剛剛進入青年期。顏色對比和管狀肢體的動感是這幅圖入選的主要因素。

魚鱗在參加以色列獸醫(yī)協(xié)會實踐時，獸醫(yī)哈維·薩爾法拍攝到了一條七彩神仙魚的魚鱗。這幅圖是在20倍顯微鏡下拍攝的，可以看到魚鱗的美麗結構和顏色。

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