藥敏試驗(yàn)（用藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物敏感度的測(cè)定）
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藥敏試驗(yàn)
用藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物敏感度的測(cè)定
用藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物敏感度的測(cè)定，以便準(zhǔn)確有效的利用藥物進(jìn)行治療。目前，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的方法主要有紙片擴(kuò)散法，稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法），抗生素濃度梯度法（E-test法），和自動(dòng)化儀器等。
基本信息
| 中文名 | 藥敏試驗(yàn) |
| 外文名 | Antimicrobial susceptibility test |
| 定義 | 體外測(cè)定藥物抑菌或殺菌能力試驗(yàn) |
| 操作方法 | 藥敏片法等 |
| 作用 | 進(jìn)行藥物敏感度的測(cè)定 |
| 簡(jiǎn)稱 | AST |
| 試驗(yàn)方法 | 紙片擴(kuò)散法，稀釋法 |
| 方法 | 紙片擴(kuò)散法等 |
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簡(jiǎn)介
體外抗菌藥物敏感性試驗(yàn)簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（AST），是指在體外測(cè)定藥物抑菌或殺菌能力的試驗(yàn)。
根據(jù)美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)近期推薦的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)非苛氧菌（腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌、和其他非腸科桿菌、葡萄球菌屬細(xì)菌、腸球菌屬細(xì)菌）和苛氧菌（嗜血桿菌屬細(xì)菌、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌和其他鏈球菌）選擇常規(guī)藥敏試驗(yàn)的首選藥物（A組抗生素）或臨床使用的主要抗生素（B組抗生素）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。
抗菌藥對(duì)細(xì)菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用，但由于養(yǎng)殖過程中不科學(xué)的、盲目的濫用抗菌藥，很多致病性細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，使得抗菌藥對(duì)細(xì)菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費(fèi)，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。
隨著新型致病菌的不斷出現(xiàn)，抗菌藥的防治效果越來越差。并且各種致病菌對(duì)不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細(xì)菌的不同菌株對(duì)不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長期以來，各種致病菌耐藥性的產(chǎn)生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能很好的掌握藥物對(duì)細(xì)菌的敏感度，所以一個(gè)正確的結(jié)果，可供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物的參考，并提高療效。農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動(dòng)物疫病診療中心總結(jié)出幾套適合基層進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的操作方法，現(xiàn)簡(jiǎn)單介紹如下。
分類
紙片擴(kuò)散法
該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時(shí)，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴(kuò)散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度，并與該藥物對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。
稀釋法
稀釋法藥敏試驗(yàn)可用于定量測(cè)試抗菌藥物對(duì)某一細(xì)菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實(shí)驗(yàn)時(shí)，抗菌藥物的濃度通常經(jīng)過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測(cè)菌肉眼可見生長的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個(gè)特定抗菌藥物的測(cè)試濃度范圍應(yīng)該包含能夠檢測(cè)細(xì)菌的解釋性折點(diǎn)（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時(shí)也應(yīng)該包含質(zhì)控參考菌株的MIC。
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)材料
普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：可去生化試劑店購買，做不同細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)可選擇不同的培養(yǎng)基，如做大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)可選擇普通營養(yǎng)瓊脂或麥糠凱培養(yǎng)基。做沙門氏菌可選擇血清培養(yǎng)基。
藥敏試紙：購買或自制（詳見實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備）。
細(xì)菌：待做藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
2.1 藥敏片的準(zhǔn)備：購買或自制
2.1.1 制備方法：取新華1號(hào)定性濾紙，用打孔機(jī)打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。
2.1.2 抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液0.25毫升，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個(gè)月。
2.2 藥液的制備（用于商品藥的試驗(yàn)）：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個(gè)比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗(yàn)的藥液。
實(shí)驗(yàn)操作方法
3.1 藥敏片法
3.1.1 在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)再涂布均勻。）
3.1.2 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。
3.1.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。
3.2 牛津杯法
3.2.1 同3.1.1
3.2.2 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，并在小管處標(biāo)記各種藥物名稱。每個(gè)平板可放4-6支小管。待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數(shù)量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養(yǎng)8-18小時(shí)，觀察結(jié)果。
3.2.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。
3.3 打孔法：
該法較簡(jiǎn)單，成本低，易操作，比較適用于商品藥物的檢測(cè)。
3.3.1 在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）
3.3.2 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結(jié)果）。
3.3.3 加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。
3.3.4 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。
結(jié)果觀察
在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對(duì)此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。
判定標(biāo)準(zhǔn)
一、藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。
抑菌圈直徑（毫米） | 敏感度 |
20以上 | 極敏 |
15~20 | 高敏 |
10~14 | 中敏 |
10以下 | 低敏 |
0 | 不敏 |
具體對(duì)于不同的菌株，及不同的抗生素紙片需參照NCCLs的標(biāo)準(zhǔn)或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)。
二、藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。
影響因素
培養(yǎng)基
細(xì)菌藥敏試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基種類較多，多數(shù)情況下，采用WHO組織統(tǒng)一要求的M—H培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基中含有的低胸腺嘧啶是與磺胺類藥物競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)，因此進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)效果較好。此外，還有適量的Ca、Mg，在培養(yǎng)基中起到觸媒的作用。但是，有些細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培養(yǎng)基才能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。例如，流感嗜血桿菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基用HTM瓊脂；淋球菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基用加5%羊血的巧克力M—H瓊脂；肺炎鏈球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)用M—H瓊脂加5%的脫纖維羊血培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還有適量的Ca、Mg，在培養(yǎng)基中起到溶酶的作用，其含量的變化，可影響氨基糖苷類和四環(huán)素對(duì)銅綠假單胞菌的試驗(yàn)結(jié)果，含量過高，抑菌圈會(huì)變小，含量過低，抑菌圈會(huì)大得不可接受。
細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基厚度大約為4mm，若培養(yǎng)基厚度大于4mm，會(huì)使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥；若小于4mm，本應(yīng)耐藥的易出現(xiàn)敏感。所以，試驗(yàn)時(shí)一定不要把藥敏紙片放在中央部位，而應(yīng)均勻地排布在平皿周圍的培養(yǎng)基上。制作藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基用水，主要是Ca、Mg、A1等礦物質(zhì)離子，也在很大程度上影響著藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。
試紙片
試紙片材質(zhì)的好壞，對(duì)藥物穩(wěn)定性和活性有很大影響。加工藥敏試紙片的試紙一般是使用加厚型的濾紙，雜質(zhì)少，對(duì)藥物保存無太大影響。然而，臨床中很多用的是普通紙，被水浸潤后會(huì)呈堿性，并且含有大量無機(jī)離子，因此使用普通紙加工的試紙片藥物有較大的影響。藥敏紙片的pH值一般要求為中性，這樣才適合藥的活度。藥敏紙片的厚度要求大約1mm，這樣才有利于細(xì)菌的生長和藥物的擴(kuò)散速度。藥敏紙片的直徑在6．00～6．35mm之間，紙片的厚度和直徑大小都會(huì)影響藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。
含藥紙片的片間差和質(zhì)量好壞是做藥敏試驗(yàn)的關(guān)鍵。一些藥敏紙片買來時(shí)就有抑菌環(huán)偏大或偏小的問題，紙片之間又存在很大的片間差。因此，紙片在用前必須檢驗(yàn)其片間差和準(zhǔn)確度，只有都達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求后才能使用。同時(shí)要注意紙片的保存，因?yàn)橛械募埰缜嗝顾仡悾诒４嬷幸驗(yàn)槭艹睗癍h(huán)境的影響容易降低其藥物的活性。因此，紙片應(yīng)放低溫下(-10℃)保存，同時(shí)要避免潮濕，以保持抗菌藥物的活性。盛紙片小瓶自低溫處取出應(yīng)在室溫平衡至少10min后再打開，避免冷凝水影響藥效。
細(xì)菌
由于各種菌對(duì)藥物的敏感性不同，產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小不同，如果菌種不純，試驗(yàn)中所產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小與該菌種在純培養(yǎng)狀態(tài)下產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小存在較大的差異，影響判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此需要對(duì)各種致病菌提純后，分別進(jìn)行不同的藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)時(shí)，需要將提純后的菌種配制成一定濃度的菌液。WHO組織制定的標(biāo)準(zhǔn)是要求菌液濃度在1．5億/ml左右。若菌液濃度過高，該菌會(huì)對(duì)所有藥物產(chǎn)生耐藥；反之，菌液濃度過低，該菌會(huì)對(duì)所有藥物均敏感。最精確的方法是使用分光光度計(jì)測(cè)定新鮮培養(yǎng)物菌懸液的吸光度，來確定菌液濃度。國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)的三級(jí)甲等醫(yī)院，其微生物實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)用此法來確定藥敏試驗(yàn)的菌液濃度。
藥敏試驗(yàn)中要將菌液均勻地涂在培養(yǎng)基上，使細(xì)菌均勻分布，這樣才能使試驗(yàn)結(jié)果不會(huì)出現(xiàn)較大的偏差。涂菌后15min才能貼藥敏紙片。由于涂菌后，細(xì)菌要有一段時(shí)間的適應(yīng)過程，但是時(shí)間不能過長，否則會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。貼藥敏紙片時(shí)，每取一種藥敏紙片必須燒一下鑷子口，避免藥敏紙片之間相互混淆，以提高藥敏的準(zhǔn)確性。藥物殺滅細(xì)菌存在一定的量比，藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基上細(xì)菌層越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根據(jù)一種藥物抑菌圈的有無或者大小，只能判斷出該藥對(duì)細(xì)菌有沒有效果，但其敏感性的高低需要通過科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來確定。藥物的敏感程度需要根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，并結(jié)合以上因素做綜合分析，才能得出科學(xué)的結(jié)論，而片面地根據(jù)藥敏圈的大小來決定敏感與否，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。
培養(yǎng)時(shí)間
一般培養(yǎng)溫度和時(shí)間為37℃8-18小時(shí)，有些抗菌藥擴(kuò)散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2~4小時(shí)，使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長，而得到較大的抑菌圈。
應(yīng)用
藥物敏感實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)選擇高敏藥物進(jìn)行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時(shí)應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，因?yàn)樗幟魧?shí)驗(yàn)是藥液直接和細(xì)菌接觸，而在給禽用藥的時(shí)候，必須通過機(jī)體的吸收才能使藥物達(dá)到一定的效果，所以在給禽用藥時(shí)，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會(huì)達(dá)到好的治療效果。
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